超高串联质谱中8种必法测基酸谱–效液相色需氨定马铃薯一

马铃薯（SolanumtuberosumL.）是超高串联仅次于小麦、稻谷和玉米的效液相色全球第四大重要的粮食作物，与小麦、谱–稻谷、质谱中种玉米、法测高粱并称为世界五大作物。定马中国主要薯类作物年种植占全国可用耕地8%左右，铃薯其中，必需马铃薯和甘薯的氨基种植面积和总产量均居世界第一位。马铃薯含有丰富的超高串联蛋白质、碳水化合物、效液相色膳食纤维、谱–矿物质元素和维生素等营养物质。质谱中种马铃薯中的法测蛋白质除了由非必需氨基酸构成外，也含有大量的定马必需氨基酸。必需氨基酸指人体不能自己合成，需要从食物中获取的氨基酸，共有8种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。必需氨基酸摄入不足会影响机体的生理机能，造成代谢紊乱、机体抵抗力下降等。世界卫生组织（WHO）把氨基酸列为人体必须的营养素之一。2015年1月，在北京举办的马铃薯主粮化发展战略研讨会，以马铃薯主粮化与国家粮食安全为主题，深入研讨了马铃薯主粮化的战略意义、发展思路、目标任务和推进途径，突显出马铃薯产业发展的新机遇，因此针对马铃薯中的必需氨基酸进行检测分析，对于优选马铃薯品种具有重要意义。

目前，马铃薯中氨基酸的研究已有报道，赵凤敏等对不同品种的马铃薯进行了氨基酸营养价值评价，并筛选出6种氨基酸营养价值较高的品种；曾凡逵等研究了马铃薯淀粉加工过程中，分离汁水回收的蛋白质氨基酸的组成，并对其进行了分析，必需氨基酸占总氨基酸的40.80%；黄闯等研究了马铃薯蛋白水解液的氨基酸组成和含量，结果表明氨基酸组成比较平衡。虽然以上研究在马铃薯氨基酸分析检测方面做出一定成果，但均采用了氨基酸自动分析仪进行分析。在氨基酸分析方面，也有研究者采用柱前衍生–高效液相色谱法进行分析，如测定灵芝孢子粉、新鲜烟叶、野芭蕉、保健食品等物质中氨基酸的含量。除此之外，超高效液相色谱–串联质谱法近年来发展迅速，在医学、食品、药品等方面被广泛应用，并且作为一种优秀的分析技术被应用于测定不同物质中的氨基酸成分，如测定天南星、橄榄果实、植物酵素、茶叶等物质中氨基酸含量。相比较氨基酸自动分析和柱前衍生–高效液相色谱法，超高效液相色谱–串联质谱法具有高灵敏度、反应条件简单、节约操作时间等优点。

目前，在采用超高效液相色谱–串联质谱法测定马铃薯中氨基酸含量方面的研究仍属空白，因此笔者建立了超高效液相色谱–串联质谱法同时测定马铃薯中缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸8种必需氨基酸的分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Ultimate3000型，美国赛默飞世尔科技公司。三重四级杆质谱仪：TSQEndura型，配备电喷雾离子源（ESI），美国赛默飞世尔科技公司。高速冷冻离心机：5430R型，德国艾本德股份公司。超声波振荡器：FB15065型，美国赛默飞世尔科技公司。涡旋混合器：MultiReax多通道型，德国海道尔夫公司。圆周振荡器：MS3digital型，德国艾卡公司。电子天平：ME204E型，万分之一，瑞士梅特勒–托利多集团。刀式混合研磨仪：GrindomixGM200型，德国莱驰公司。均质机：T18digital型，德国艾卡公司。超纯水机：Milli-Q型，美国默克公司。

17种氨基酸混合标准溶液：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸的质量浓度均为2.50μmol/mL，日本和光纯药工业株式会社。色氨酸标准品：纯度为99.9%，中国食品药品检定研究院。甲醇：色谱纯，德国CNW公司。甲酸：色谱纯，天津市福晨化学试剂厂。马铃薯样品：品种分别为福瑞特、226、黑心一号和青九，分别采自乌兰忽洞村、吉恒太村、红崖湾和新民村。实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：AccucoreHILIC柱（150mm×2.1mm，2.6μm，美国ThermoFisher公司）；保护柱：AJO–4287C18柱（4mm×3mm，美国Phenomenex公司）；柱温：30℃；进样室温度：10℃；流动相：含0.1%（体积分数）甲酸的55%（体积分数）甲醇水溶液；等度洗脱；流量：0.20mL/min；进样体积：2μL。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）模式；离子源温度：350℃；离子传输管温度：350℃；离子喷雾电压：4500V；鞘气流量：8.0L/min；辅助气流量：3.0L/min；碰撞气：氩气；8种必需氨基酸的MRM质谱参数见表1。

1.3 溶液配制

1.3.1 色氨酸标准储备液

准确称取色氨酸标准品于50mL容量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至标线，上下颠倒混匀，制得质量浓度为2.50μmol/mL的色氨酸标准储备液。

1.3.2 氨基酸系列混合标准工作溶液

吸取17种氨基酸混合标准溶液150μL，再吸取1.3.1中色氨酸标准储备液150μL，用超纯水定容至10mL，得到质量浓度均为37.5μmol/L的混合标准中间液，再根据需要，采用超纯水配制成缬氨酸、苏氨酸、亮/异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸的质量浓度均分别为0.2、0.9、1.9、2.8、3.8、4.7、5.7μmol/L，色氨酸质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.4、1.9μmol/L，赖氨酸质量浓度分别为0.9、2.4、3.8、5.2、6.6、8.0、9.4μmol/L的氨基酸系列混合标准工作溶液。

1.4 样品处理

马铃薯洗净切块，研磨并匀浆，精密称取1g（精确至0.0001g）混合均匀的样品，置于50mL离心管中，加入25mL超纯水，涡旋，振荡，混合，超声提取10min，以10000r/min速率于4℃条件下离心10min，吸取上清液200μL，用水定容至10mL，上下颠倒，摇匀，溶液过0.22μm微孔滤膜，注入液相色谱质谱仪，待测。

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